紫外分光光度法测定蛋白质浓度时理解和使用消光系数

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尽管⾸次报道是在20世纪50年代，但使⽤直接测量280 nm吸光度来定量蛋⽩质浓度仍然是⼴泛使用的蛋⽩质测量生化测定⽅法。这一成功可以说与几个⽅⾯有关：该测定是所有蛋⽩质定量测定中最快的方法之一，不需要试剂，并且不涉及孵育或其他准备步骤。它通常可以在不准备任何特殊蛋⽩质标准品的情况下运⾏，并且如果需要，可以进一步回收蛋⽩质样品以用于下游应⽤。由于这些优点，该测定通常用于快速估算蛋⽩质浓度。

1、280nm紫外分光光度法测定蛋白质浓度的基础

在280nm波⻓下，芳⾹族氨基酸：⾊氨酸 (Trp) 和酪氨酸(Tyr) 表现出强烈的光吸收，并且在较小程度上形成⼆硫键 (Cys-Cys) 的半胱氨酸基团也会光吸收。因此，蛋⽩质和肽在280 nm处的吸收与这些氨基酸的含量成正比。然而，给定蛋⽩质的光吸收并不严格取决于氨基酸含量，还取决于缓冲液类型、离子强度和蛋⽩质溶液的pH值。同一蛋⽩质的不同制剂在蛋⽩质构象和翻译后修饰（例如氧化、糖基化）⽅⾯可能具有高度异质性，这可能进一步影响蛋⽩质的光吸收。

可以为任何给定的蛋白质建立光吸收系数，也称为消光系数（ε）。对于每种蛋⽩质或肽，基于氨基酸的光吸收是相加的前提，可以通过实验确定或根据氨基酸序列计算消光系数。

除了其固有的吸收率之外，蛋⽩质还会按照其浓度成比例地吸收紫外线。这种关系已被用于蛋⽩质浓度的紫外-分光光度测定，并由⽐尔-朗伯定律Beer–Lambert law（或比尔定律）定义。比尔定律描述了蛋⽩质吸光度对其光吸收系数、浓度和⼊射光路径长度的依赖性。

公式1

A=εcL

其中，

A：样品的吸光度（无单位）

ε：蛋⽩质的摩尔消光系数或摩尔吸收率（M^‒¹ cm^‒¹)

c：蛋⽩质浓度（摩尔单位，M）

L：长度（cm）

基于280 nm处测得的吸光度的蛋⽩质浓度可以很容易地从上⾯的等式中得出：

公式2

c = A/εL

尽管其数学公式简单，但在某些情况下该公式的应用可能很困难，特别是当可⽤不同的消光系数时。

2、理解和使用消光系数

对于任何给定的蛋⽩质，最可靠的消光系数显然是可以使⽤溶解在用于后续下游应用的相同缓冲液中的已知浓度的蛋⽩质进⾏实验测量的系数（实验方法确定消光系数，Amgen近期的报道：Dipanwita B, Harrison L, Ben A, Mats W (2021) Determination of the experimental extinction coefficient of therapeutic proteins using the Edelhoch method. Biologicals 71: 42-47，用Edelhoch法测定蛋白药物的实验消光系数）。然⽽，其他⼏种估计⽅法速度更快，并且仍然足够准确，可以确定⼤多数实验室应⽤的蛋⽩质浓度。例如，水中任意蛋⽩质在280 nm处的消光系数理论上可以通过前⾯提到的三种氨基酸的280nm吸收系数的加权和来估计：

公式3

ε=(nWx5500)+(nYx1490)+(nCx125)

其中，

W：⾊氨酸

Y：酪氨酸

C：半胱氨酸

n：蛋⽩质中存在的每个残基的数量

5500、1490和125：分别是 W、Y和C在280 nm处的摩尔吸光率

⽬前这些理论值是用计算⼯具计算的，唯一的必要条件或所需的输⼊是蛋⽩质的一级序列。对于消光系数的计算，一个流⾏且免费的解决方案是瑞士生物信息研究所提供的ProtParam™工具（https://web.expasy.org/protparam/）。ProtParam工具利用上述公式计算消光系数。该程序生成两个消光系数值。第一个值的计算假设蛋⽩质中的所有半胱氨酸残基都形成⼆硫键 (C-C)，而第⼆个值的计算假设所有半胱氨酸残基均处于还原状态，即不形成⼆硫键。这种消光系数的计算对于含⾊氨酸的蛋⽩质来说相当可靠，但对于不含⾊氨酸残基的蛋⽩质来说很容易出错。

许多不同蛋⽩质的消光系数已在⽂献中汇编。例如，在《Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology》以及专业科学期刊中都有报道。文献中报道的大多数测量都是在水性缓冲液中进行的，例如磷酸盐、HEPES或Tris-HCl缓冲液。因此，可以选择在与感兴趣的样品相似的缓冲液中溶解的蛋白质所获得的消光系数值。可以得出结论，大多数蛋⽩质都可以获得预测或实验的消光系数数据。

由于消光系数的报告在⽂献中尚未标准化，因此蛋⽩质浓度的计算可能有些挑战性。例如，经常报告1%蛋⽩质溶液（ε_1%或ε_{1 percent}）或0.1%蛋白质溶液 (ε_0.1%)的吸光度值(A280) ，而不是公式2中显示的摩尔消光系数。摩尔消光系数和质量消光系数的定义如下：

ε_molar是摩尔消光系数或蛋白质的摩尔光吸收率，以M^‒¹ cm^‒¹ 表示；

ε_1%是在1 cm比色皿中测量的参考蛋白的1%或10 mg/mL溶液的质量消光系数或百分⽐溶液消光系数（280 nm处的吸光度值），表示为10 (mg/mL)^‒¹(cm)^‒¹；

ε_0.1%是在1 cm比色皿中测量的参考蛋白的0.1%或1 mg/mL溶液的质量消光系数或百分比溶液消光系数（280 nm处的吸光度值），表示为(mg/mL)^‒¹(cm)^‒¹；

在比尔定律（公式1）中，包含摩尔消光系数(ε_molar)并获得摩尔浓度。因此，摩尔浓度应乘以蛋⽩质的分⼦量，以mg/mL表示最终蛋⽩质浓度。相反，当在比尔定律中使用质量消光系数值（ε_1%或ε_0.1%）时，结果直接表示为1%（10 mg/mL）或0.1%（1 mg/mL）的质量百分比。当使用ε_1%时，需要应⽤调整因子10以mg/mL表示最终蛋⽩质浓度。

例如，目前可用于牛血清⽩蛋⽩ (BSA) 的许多消光系数或光吸收率值，通过快速搜索，可以找到⽂献中报告的几个值（表1）。

表1、BSA的消光系数示例

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当从现有数据中选择值时，优选通过实验确定的消光系数；然⽽，如上所述，这些值可能会根据所选缓冲液以及其他因素⽽有所不同。一般来说，⽤还原状态的Cys残基进行的 ProtParam 预测可⽤于大多数蛋⽩质。

对于BSA，280 nm处的ε_1%值为6.7（或ε_0.1%值为0.67）是普遍接受的。根据公式4中的ε_1%和ε_molar之间的关系，并假设BSA的分⼦量（MW）为66400，可以计算出6.7的消光系数对应于44488M^‒¹ cm^‒¹的ε_molar，这很接近Gill和von Hippel的报道。

公式4

ε_molar= MW x ε_1%/ 10

其中，

ε_molar是摩尔消光系数或蛋白质的摩尔光吸收率，以M^‒¹ cm^‒¹表⽰；

ε_1%是在1 cm比色皿中测量的参考蛋白的1%或10 mg/mL溶液的质量消光系数或百分比溶液消光系数（280 nm处的吸光度值），表示为10 (mg/mL)^‒¹(cm)^‒¹；

MW是蛋白质的分子量；

总体而言，质量消光系数是更容易处理的数字，因此经常使用。ε_0.1%特别方便，因为它提供 0.1% (1 mg/mL)蛋白质溶液的吸光度值。在这种情况下，可以直接应⽤比尔定律公式计算蛋白质浓度（以mg/mL为单位），而无需使用调整因⼦。

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